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探討腸炎弧菌 VPA1681 基因抵抗有機過氧化壓力的機制

為了解決Remove bg的問題，作者陳寧辛 這樣論述：

腸炎弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 是一種在台灣引發食物中毒事件最高的細菌，主要透過存在於海產上從而感染人類。腸炎弧菌為一海洋弧菌，在環境中生存會面臨許多外在的環境壓力，而這些壓力往往會伴隨或引起氧化壓力。致病菌的存活與活性氧化因子 (Reactive oxygen species, ROS) 有關，可以通過研究腸炎弧菌的抗氧化因子的特性，從而瞭解腸炎弧菌的存活、調控與變異的機制。腸炎弧菌本身具有各種抗過氧化物酵素，其中包含 superoxide dismutase、catalase、alkyl hydroperoxide reductase subunit C (

AhpC) 等能轉化、分解或消除對菌體造成傷害的 ROS 的酵素。在這些酵素中 AhpC 主要用於降解有機過氧化物，前人研究中已發現腸炎弧菌有 ahpC1 (VPA1683) 和 ahpC2 (VPA0580) ，這兩個基因主要受到 oxyR (VPA2752) 所調控。而 VPA1681，核酸序列上似可命名為ohrA (Organic hydroperoxide resistance gene) ，ohrA 與其調控的 ohrR (VPA1682) 未曾被探討過。本研究利用 in frame-deletion mutation 的方式分別建構腸炎弧菌 1173 菌株的 ohrA 單突變株、o

xyR 和 ohrA 雙突變菌株、 ahpC1 與 ahpC2 與 ohrA 叁突變及相關互補株，探討 ohrA 氧化壓力調控功能。首先常態培養下 ohrA 的缺失並不會影響菌株本身的正常生長。在氧化壓力生長測試中加入有機過氧化物 cumene hydroperoxide (CHP) 作用，野生菌株 1173 生長情形優於 ohrA 單突變菌株， oxyR 單突變株生長情形優於 oxyR 和 ohrA 雙突變菌株，ahpC1 與 ahpC2雙突變株生長情形優於 ahpC1 與 ahpC2 與 ohrA 叁突變菌株。當缺失 ohrA 基因的突變菌株互補回 ohrA 基因時，生長情形接近回復至未突

變時的狀態。其中 ahpC1與 ahpC2 與 ohrA 叁突變菌株生長情形最差，在 20 μM CHP 就幾乎無法生長。這些說明在腸炎弧菌中 ahpC1、ahpC2 和 ohrA 作為主要抗有機過氧化物基因，且 ohrA 在 ahpC1、ahpC2 基因缺失後扮演很重要的角色；而加入無機過氧化物 H2O2作用時，所有菌株生長情形無差異，說明缺失 ohrA 不會使得菌株對無機過氧化物變得敏感。之後外加足以殺傷菌株的 CHP 作殺傷測試和 disk diffusion，也是與有氧化壓力生長測試呈現相同結果。用 Reverse transcription polymerase chain reac

tion (RT-PCR) 驗證上述實驗結果， ohrR 基因缺失後 ohrA 基因表現量相比 ohrR 基因未突變時明顯增加，表明 ohrA受到屬於 MarR family 中的 ohrR (Organic hydroperoxide resistance gene regulator, VPA1682) 負調控。在野生菌株 1173、ΔrpoS、ΔoxyR 中 ohrA 隨 CHP 作用濃度增加基因量並不明顯，ohrA 在 ahpC1 和 ahpC2 缺失後表現量會更加明顯。另外有趣的是， ahpC2 並不完全受 oxyR 所調控。最後使用純化的 OhrA 蛋白處理有機過氧化物，發現 Oh

rA 蛋白的確有減低有機過氧化物毒性的功能，使菌株在同等壓力下存活率明顯提升。綜上所訴 OhrA 幫助腸炎弧菌耐受有機過氧化壓力，在有機過氧化壓力調控系統中扮演一定角色。